Informasi tentang jenis SNP diperoleh dari pembelajaran tentang gen kumpulan penyakit dan menganalisis struktur gen populasinya. Untuk beberapa tahun RFLP-PCR merupakan metode yang relatif sederhana dibandingkan dengan metode lain, seperti reaksi deteksi ligase dan D-HPLC. Tetapi metode asli dari RFLP-PCR mempunyai keterbatasan, dimana kenyataannya sisi daerah sebagian besar loci SNP tidak mempunyai kecocokan dengan tapak pengenalan endonuklease retriksi (RER). Metode tersebut diperbarui dengan mengubah satu atau dua basa pada sequence yang berdekatan pada SNP dengan primer yang tidak sesuai untuk membentuk tapak RER, tapi penambahan satu atau dua basa tidak cukup kompeten untuk mengenali sequence RER, biasanya dengan panjang 4-6 bp.
Pada metode ini digunakan model khusus primer PCR yang tidak sepadan, umumnya Hind III, EcoR I atau Bam I untuk mengenali tapak RER pada sisi daerah loci SNP dengan merubah 4-5 basa setelah dua siklus amplifikasi PCR. Sistem reaksi pada siklus pertama terdiri atas 1-5 ng genom DNA dengan mengisolasi dari sekeliling leukosit yang diperoleh dari populasi orang Cina dengan menggunakan metode phenol-chloroform.
Dalam metode ini dilakukan dengan mencampur 200µM dNTPs, 2.0 mM MgCl2, 1.0µM dari tiap primer forward dan reserve, dan 0.5 u Tag polimerase dan diperoleh volume akhir 5µL dari reaksi pencampuran. Siklus pertama reaksi PCR menggunakan inisiasi denaturasi pada suhu 94C selama 5 menit yang dilanjutkan dengan siklus denaturasi pada suhu 94C selama 30 detik, tahap annealing pertama pada suhu 63C selama 30 detik dengan penurunan suhu 0.5C tiap siklus dari siklus pertama, tahap annealing kedua pada suhu 45C selama 10 detik, dan extension selama 5 detik pada suhu 72C. Hal tersebut dilanjutkan sampai 30 siklus pada suhu 94C selama 30 detik, 5 detik pada suhu 65C, 30 detik pada suhu 56C, 10 detik pada suhu 45C, dan 50 detik pada suhu 72C dan terakhir extension pada suhu 72C selama 7 menit. Produk tahap pertama dicairkan 10 kali dan digunakan sebagai template untuk reaksi kedua dalam 1µL produk PCR cair yang ditambahkan untuk reaksi akhir dengan volume 30µL. Untuk reaksi akhir ini terdiri atas campuran 200µM dNTPs, 1.5 mM MgCl2, 3.0 µM dari tiap primer forward dan reserve khusus dan 2 u Tag polimerase. Reaksi ini diset pada inisiasi denaturasi pada suhu 94C selama 5 menit yang diteruskan sampai 45 siklus pada 94C selama 30 detik, 56C selama 40 detik, 45C selama 10 detik, dan 72C selama 50 detik, dan terakhir extension selama 5 menit pada suhu72C.
Setelah dua siklus amplifikasi, biasanya tapak RER telah dikenali oleh produk dari satu alel pada SNP dan 2µL dari produk PCR yang dimungkinkan sesuai dengan endonuklease sebelum elektroforesis pada media 3% gel agarose dan genotip yang terpisah.
Pada metodologi ini digunakan tiga jenis gen CYP3A4 SNPs (CYP3A4*1B, CYP3A4*6 dan rs#2242480) yang diperoleh dari wanita Cina berumur 17-19 tahun. Untuk jenis genotipnya, diperoleh dari sampel darah (5mL) yang diambil dari tiap individu dan mengekstrak genom DNA melalui metode standart dan dilanjutkan dengan reaksi yang telah diuraikan diatas.
Gen CYP3A4 yang dikode oleh kelompok Cytochrome P450 yang berperan dalam metabolisme oksidasi-reduksi dari berbagai jenis endogen dan eksogen dan mengandung SNPs. Dengan menggunakan metode yang diuraikan diatas, tiga tapak RER dapat dikenali oleh tiga SNPs yang telah diseleksi pada gen CYP3A4. Pada penelitian yang lebih lanjut diketahui bahwa ketidaksesuaian sequence nukelotida pada primer ujung 3’ menyebabkan reaksi PCR tidak dapat berfungsi dengan baik. Efek ini diketahui dengan mensintesis tiga primer reverse pada sequence rs#2242480 yang mempunyai perbedaan jumlah basa ujung 3’ yang mengalami ketidaksesuaian. Setelah 25 siklus pertama ternyata menunjukkan penurunan efisiensi amplifikasi namun mengalami peningkatan setelah 35 siklus dan dihasilkan beberapa perbedaan pada primernya dan produk PCR dapat diperoleh jenis RFLP.
RLFP-PCR merupakan merode yang sederhana dan sesuai untuk tiap SNP. Untuk sebagian besar SNPs, tapak RER biasanya dapat dengan mudah dalam bentuk satu alel dari SNP dan RFLP dapat memperoleh sampel DNA yang murah tanpa membutuhkan alat yang khusus.
sumber : Anik Wulandari, mahasiswa biologi FMIPA UM